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Banca de DEFESA: DANILO NOBRE DA SILVA
31/08/2021 09:10


Uma banca de DEFESA de MESTRADO foi cadastrada pelo programa.
DISCENTE: DANILO NOBRE DA SILVA
DATA: 29/10/2021
HORA: 09:00
LOCAL: Online
TÍTULO: PADRONIZAÇÃO DE UM TESTE IMUNOENZIMÁTICO QUANTITATIVO ANTI-IgG PARA O SARS-CoV-2
PALAVRAS-CHAVES: SARS-CoV-2; proteína recombinante; ELISA.
PÁGINAS: 49
GRANDE ÁREA: Ciências da Saúde
ÁREA: Farmácia
RESUMO:

O padrão ouro para diagnóstico da COVID-19 é a reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa (RT-PCR). Os testes imunocromatográficos e sorológicos por sua vez, são baseados na pesquisa de anticorpos contra o SARS-CoV-2 e recomendados para investigar a prevalência da infecção. Desde o início da pandemia da COVID-19 foram desenvolvidos testes sorológicos qualitativos e quantitativos, alguns deles apresentando baixa especificidade e sensibilidade. No lado oposto, está o ensaio imunoenzimático (ELISA), utilizado em diagnósticos de inúmeras infecções e queapresenta alta sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade. Sendo assim se propôs nesta dissertação, padronizar um ensaio de ELISA quantitativo para diagnóstico e acompanhamento da COVID-19. Foram realizados testes em amostras de pacientes com COVID-19 para padronização da técnica de ELISA quantitativo indireto para a detecção de IgG. Primeiramente, foi realizada a determinação da concentração daproteína N para sensibilização das placas e bloqueio de ligações inespecíficas. Em seguida, foram testadas diluições dos anticorpos primários anti-SARS-CoV-2-IgG. Logo após, foi avaliada a diluição do anticorpo secundário anti-IgG humano ligado à peroxidase. Por fim, foram determinados a curva padrão, o cut off, e realizados testes de sensibilidade e especificidade do teste. Os resultados obtidos foram: a concentração inicial para sensibilização das placas, de 50 ng/poço de proteína N, e bloqueio após sensibilização da placa, com albumina bovina sérica (BSA) 0,1%, demonstraram ocorrência de ligações inespecíficas observadas nas absorbâncias das amostras positivas e negativas (>1,826). Foi alterado o bloqueio para BSA 0,5% + leite 3% e concentração da proteína N (100 ng/poço), resultando em absorbâncias ainda altas (>1,536). Em seguida, o bloqueio foi realizado com BSA 2% e a concentração da proteína N (100 ng/poço), resultando em absorbância média de 0,320. Para adeterminação da diluição do anticorpo primário, realizou-se uma diluição seriada para testar a reatividade da proteína com os anticorpos presentes nos soros. De acordo com a média das absorbâncias das amostras testadas (negativas: 0,261 / positivas: 0,398) foi estabelecida a diluição de 1/500. Logo após, foi determinada a diluição 1/10.000 do anticorpo secundário, porém com os ajustes da concentração de adsorção e do anticorpo primário, foi determinado utilizar a diluição 1/20.000. Por fim, foi determinado o limiar de reatividade (cut off) a partir da média de soros controles negativos obtidos em março de 2019, antes da existência do novo coronavírus e foi testada a curva padrão em: 1/2.000, 1/3.000, 1/5.000, 1/8.000, 1/10.000, 1/13.000, 1/16.000 e 1/20.000

resultando em absorbâncias muito próximas e elevadas (R²=0,8820). Posteriormente, foi

realizada a variação 1/10.000, 1/20.000, 1/40.000, 1/60.000, 1/80.000, 1/100.000,

1/140.000 e 1/200.000 resultando em R²=0,967, indicando melhor correlação. O nível de

significância estatística estabelecida foi de p< 0,05 para todos os testes. Com isso, o

teste de ELISA quantitativo indireto foi padronizado para a detecção de anticorpos IgG

anti-SARS-CoV-2, determinando, então, a concentração adequada do antígeno

(proteína N), as diluições ideais do anticorpo primário e secundário, o limiar de

reatividade (cut off) e a da curva-padrão, gerando um teste de alta qualidade, alta

sensibilidade, alta especificidade e baixo custo.


MEMBROS DA BANCA:
Externo à Instituição - CLIOMAR ALVES DOS SANTOS
Presidente - 1718309 - DULCE MARTA SCHIMIEGUEL MASCARENHAS LIMA
Externo ao Programa - 2087772 - RAFAEL CIRO MARQUES CAVALCANTE

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