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Banca de QUALIFICAÇÃO: DANILO NOBRE DA SILVA
20/07/2021 07:48


Uma banca de QUALIFICAÇÃO de MESTRADO foi cadastrada pelo programa.
DISCENTE: DANILO NOBRE DA SILVA
DATA: 26/07/2021
HORA: 09:00
LOCAL: Online
TÍTULO: : AVALIAÇÃO DA ANTIGENICIDADE DA PROTEÍNA RECOMBINANTE “N” DO SARS-CoV-2
PALAVRAS-CHAVES: SARS-CoV-2, antigenicidade, proteína recombinante, ELISA
PÁGINAS: 33
GRANDE ÁREA: Ciências da Saúde
ÁREA: Farmácia
RESUMO:

O padrão ouro para diagnóstico da COVID-19 é a reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa (RT-PCR). Os testes imunocromatográficos e sorológicos por sua vez, são baseados na pesquisa de anticorpos contra o SARS-CoV-2 e recomendados para investigar a prevalência da infecção. Desde o início da pandemia da COVID-19 foram desenvolvidos testes sorológicos qualitativos e quantitativos, alguns deles apresentando baixa especificidade e sensibilidade. O ensaio imunoenzimático (ELISA), utilizado desde a década de 1970 em diagnósticos de inúmeras infecções, apresenta alta sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade. Esta metodologia pode empregar ferramentas biotecnológicas como as proteínas recombinantes, como antígenos com potencial imunogênico ou anticorpos. Dentre as proteínas recombinantes do SARS-CoV-2, destacam￾se as proteínas: “N”, “S” e “C”. O objetivo deste trabalho foi avaliar a antigenicidade da proteína recombinante “N” do SARS-CoV-2. Foram realizados testes em amostras de pacientes com COVID-19, por meio da detecção de IgG total pela técnica de ELISA quantitativo indireto, iniciando com a padronização da técnica. No TESTE 1 foi avaliada a concentração da proteína N para sensibilização da placa e bloqueio de ligações inespecíficas. Em seguida no TESTE 2 foi testada a melhor diluição do anticorpo primário anti-SARS-CoV-2-IgG (amostras). No TESTE 3 foi avaliada a melhor diluição do anticorpo secundário anti-IgG humano (Invitrogen). E finalmente nos TESTES 4 e 5 foi avaliada a curva padrão em diferentes concentrações do anticorpo secundário. Serão realizados também o teste de imunogenicidade em camundongos e a avaliação do imunoconteúdo da proteína pela técnica de Western Blot. Os resultados obtidos até o momento foram: TESTE 1: concentração inicial para sensibilização das placas, de 50 µg/mL de proteína N, e bloqueio após sensibilização da placa, com albumina bovina sérica (BSA) 0,1%, demonstraram ocorrência de ligações inespecíficas observadas nas absorbâncias (>1,826). Foi alterada a solução de bloqueio para BSA 0,5% + leite 3% e concentração da proteína N para 100 µg/mL, resultando em absorbâncias ainda demasiado altas (>1,536). Em seguida, o bloqueio foi realizado com BSA 2% e a concentração da proteína N de 100 µg/mL, resultando em absorbância média de 0,320. TESTE 2: determinação da diluição do anticorpo primário anti-SARS-CoV-2-IgG, realizou-se, uma diluição seriada para testar a reatividade da proteína com os anticorpos presentes nos soros. De acordo com a média das absorbâncias das amostras testadas (negativas: 0,261 / positivas: 0,398) foi estabelecida a diluição de 1/500 (anticorpo primário). No TESTE 3 foi determinada a diluição 1/10.000 do anticorpo secundário, porém com os ajustes da concentração de adsorção e do anticorpo primário, foi reavaliado utilizar a diluição 1/20.000 resultando em melhores absorbâncias nessas condições. Nos TESTES 4 e 5 foi testada a curva padrão com as seguintes diluições do anticorpo secundário: 1/2.000, 1/3.000, 1/5.000, 1/8.000, 1/10.000, 1/13.000, 1/16.000 e

1/20.000 resultando em absorbâncias muito próximas e elevadas (R²=0,8820).
Posteriormente, foram realizadas duas variações da diluição do anticorpo secundário:
1/5.000, 1/8.000, 1/12.000, 1/16.000, 1/20.000, 1/24.000, 1/28.000, 1/30.000; e 1/10.000,
1/20.000, 1/40.000, 1/60.000, 1/80.000, 1/100.000, 1/140.000 e 1/200.000 resultando em
R²=0,967, indicando esta última a melhor correlação.

MEMBROS DA BANCA:
Presidente - 1718309 - DULCE MARTA SCHIMIEGUEL MASCARENHAS LIMA
Interno - 2027473 - MARCELO CAVALCANTE DUARTE
Externo ao Programa - 2087772 - RAFAEL CIRO MARQUES CAVALCANTE

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